En 2020, el concepto fue digno de un Premio Nobel: crispr-cas9, la práctica técnica de cortar y pegar para la edición de ADN. Esto permite a los investigadores desconectar genes con gran precisión, corregirlos o insertar nuevos genes. Surgieron ambiciones en todo el mundo: podíamos doblar el ADN a nuestra voluntad como maestros de Lego.
Hasta cierto punto, esto está sucediendo ahora: los científicos lo han estado usando durante diez años. crispr-cas9 en sus laboratorios, por ejemplo, para averiguar la función de los genes. Pero restaurar los trastornos genéticos en los pacientes, la máxima promesa, solo ocurre en los ensayos clínicos. edición de genes con los embriones, el futuro ya es cosa del pasado.
¿Cómo ocurrió eso? ¿Por qué la clínica está tan detrás de esas altas expectativas? Y sobre todo: ¿qué se puede hacer al respecto? Investigadores del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) publicado sobre esto un artículo en la revista a finales de enero Informes de celda. Con una solución relativamente simple al problema más importante.
“Una de las dificultades con crispr-cas9 es la influencia negativa de un mecanismo celular que normalmente es útil: la reparación del ADN”, dice el autor principal Joost Schimmel. “Tan pronto como se produce una ruptura en el ADN, las enzimas repararán esa ruptura lo más rápido posible. También hacen esto tan pronto como crispr-cas9 hace una ruptura en el ADN. Solo entonces esto contrarresta el cambio deseado en el ADN”.
Mutaciones patógenas
Como resultado, la eficiencia de crispr-cas9 también es considerablemente menor. Por lo general, solo alrededor del 5 por ciento de las celdas después de crispr-cas9 contienen el cambio deseado. Schimmel: “En otros casos, esta reparación del ADN a menudo provoca mutaciones aleatorias en el ADN, es decir, cuando los extremos se juntan de manera incorrecta. Esos cambios pueden causar problemas”.
Junto con Marcel Tijsterman, profesor de estabilidad del genoma en la Universidad de Leiden, Schimmel está investigando exactamente cómo funciona la reparación del ADN y cuáles son las consecuencias. “La recuperación del ADN no siempre sale bien de forma natural”, dice Tijsterman. “Esto a veces provoca mutaciones en el ADN que pueden causar cáncer. Esa es una de las principales razones por las que todavía somos muy cautelosos con la aplicación de crispr-cas9 en la clínica”.
Las enzimas que reparan las roturas del ADN en las células a menudo se denominan polimerasas: enzimas que pueden ensamblar polímeros, es decir, moléculas largas, en este caso moléculas de ADN, que consisten en largas cadenas de nucleótidos. “Descubrimos que una de esas polimerasas, la ADN polimerasa theta, es responsable de un modo específico de reparación del ADN. Y esa es exactamente la forma en que causa tantos errores”.
La eficiencia del crispr-cas9 aumentó del 5 al 50 por ciento
Marcel Tijstermann profesor
Se trata de los llamados unión final, donde los cabos sueltos se unen, lo que hace que se pierdan fragmentos de ADN. Esto contrasta con la reparación del ADN, en la que la enzima repara la ruptura sobre la base de una «pieza de ejemplo» de ADN disponible, que puede agregar durante el crispr-cas9. “La unión de extremos es muy común en crispr-cas9”, explica Schimmel, “mientras que en muchos casos prefiere ver esa otra forma. Esto le permite cambiar los genes de una manera predecible y, por lo tanto, corregir las mutaciones patogénicas”.
“Pensamos: si inhibimos esa unión de extremos ahora, entonces esa otra forma podría tomar la delantera”, continúa Tijsterman. “Y eso es exactamente lo que vimos suceder. La eficiencia del crispr-cas9 aumentó del 5 al 50 por ciento. Una mejora realmente significativa.”
Bloquear enzima
La sustancia con la que los residentes de Leiden bloquean la enzima es una pequeña molécula que es muy similar a los nucleótidos, los componentes básicos, del ADN. Como resultado, encaja exactamente en el llamado sitio activo de la enzima: el lugar con el que se une al extremo suelto del ADN y le une nuevos nucleótidos, como la cremallera de una cremallera. De esta forma, la molécula inhibe la acción de la enzima.
“Este inhibidor es una sustancia que ya se está utilizando en la biología del cáncer para inhibir la ADN polimerasa theta”, dice Tijsterman. “En determinados cánceres de mama hereditarios, por ejemplo los asociados a los llamados genes BRCA, el problema radica precisamente en la misma forma de reparación del ADN. La unión de extremos conduce a reparaciones defectuosas que pueden provocar células cancerosas. Aquí, también, las personas están investigando la inhibición de la ADN polimerasa theta para evitar que ese extremo se una”.
fluorescente
¿No era entonces muy obvio que esta molécula y este enfoque también podrían ayudar a mejorar crispr-cas9? “A veces estás tan concentrado en una cosa que no ves la otra”, responde Tijsterman. “Yo mismo estoy más interesado en la biología del cáncer que en las aplicaciones de crispr-cas9, por eso. Y nunca se sabe de antemano lo que sucederá en una célula si se inhiben ciertos mecanismos. ¿Se hace cargo entonces otro mecanismo, o simplemente muere la célula? Eso resulta funcionar bien para crispr-cas9”.
¿Cómo investigas eso realmente? “A nivel genético, podemos usar la secuenciación para demostrar después qué ha cambiado”, responde Schimmel. “Entonces, mapeando la secuencia de ADN. De esta manera, puede demostrar la frecuencia de una determinada mutación para millones de células al mismo tiempo”.
Pero para monitorear lo que sucede en vivo, los investigadores también usan células específicas en el laboratorio. Schimmel: “Por ejemplo, células que producen una proteína verde fluorescente. Con crispr-cas9 podemos modificar muy fácilmente el ADN de esas células de tal manera que emitan fluorescencia azul en lugar de verde. Por ejemplo, sin inhibidores de unión de extremos, vemos un 5 por ciento azul fluorescente. Con los inhibidores, de repente se convierte en 50 a 70 por ciento”.
Todavía hay mucho que realmente necesitamos resolver primero
Joost Schimmel investigador
Tijsterman: «Eso es fantástico, que puedas verlo bajo el microscopio». Los colegas casi se caen de sus sillas cuando vieron los resultados, dice el profesor. “Algunos han luchado durante años con bajas tasas de éxito. Realmente espero que todos los que trabajan con crispr-cAS9 ahora agreguen estos inhibidores”.
Esto no significa necesariamente que este enfoque conquistará rápidamente la clínica, enfatizan ambos investigadores. “Todavía hay mucho que realmente tenemos que descubrir primero”, dice Schimmel. “Por ejemplo: ¿por qué está aumentando la participación de ese otro mecanismo de reparación? ¿Es porque mueren más células en otras áreas? ¿O porque la célula hace un uso más eficiente de la plantilla de ADN que agrega? ¿Y existen posibles consecuencias adversas del uso de estos inhibidores? Realmente necesitamos entender mejor esa base primero”.
“Esta sustancia no es inmediatamente la píldora milagrosa”, dice Tijsterman, “pero inmediatamente hace que esta técnica sea mucho más bella y mejor”.